Os ambientes estuarinos representam zonas ecologicamente sensíveis, sujeitas a intensas pressões antrópicas, como o descarte de efluentes industriais, urbanos, agrícolas e dragagens em ambientes portuários. A qualidade do sedimento é a mais afetadas nesses ecossistemas, que funcionam como reservatórios de contaminantes orgânicos e inorgânicos. Como avaliação ecotoxicológica, destacam-se o ouriço-do-mar Arbacia lixula e o anfípoda Grandidiriella bonnieroides. Este estudo avaliou os organismos A. lixula e G. bonnieroides como bioindicadores da toxicidade de sedimentos no estuário do rio Itajaí-açu, entre os anos de 2022, 2023 e 2024, através dos ensaios de interface sedimento:água (A. lixula) e sedimento total (G. bonnieroides). As coletas ocorreram nos meses de fevereiro, abril, agosto e novembro de cada ano, sendo 8 pontos de coleta, divididos 4 pontos dentro do canal de navegação e 4 pontos na zona costeira, totalizando 12 amostragens. Esta avaliação levou em consideração valores de toxicidade e amônia. Para os ensaios de A. lixula dentro do canal de navegação não houve diferença significativa para a toxicidade e para a amônia entre os anos, entretanto para a zona costeira ocorreu uma diferença significativa entre a toxicidade, mas não houve diferença significativa para os valores de amônia. Já os ensaios com G. bonnieroides apresentaram variações significativas na toxicidade entre os anos analisados, sugerindo sensibilidade do organismo às mudanças nas condições ambientais ao longo do período. A. lixula apresentou variações significativas na zona costeira, enquanto G. bonnieroides foi sensível às mudanças temporais entre os anos analisados. A ausência de correlação com os níveis de amônia indica a influência de outros contaminantes e a utilização conjunta desses organismos permite uma avaliação mais abrangente e precisa da qualidade ambiental estuarina.